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自噬检测
自噬是指膜包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等形成自噬体,并与内涵体形成所谓的自噬内涵体,最后与溶酶体融合形成自噬溶酶体,降解其所包裹的内容物,以实现细胞稳态和细胞器的更新。
1)透射电镜观察自噬:自噬体属于亚细胞结构,普通光镜下看不到,直接在透射电镜下观察自噬不同阶段的形态变化是一种非常直接的方法。自噬各阶段的形态学特征如下表:
自噬标志 | 形态学特征 | 自噬阶段 |
隔离膜 | 新月状或杯状,双层或多层膜,有包绕胞浆成分的趋势 | 自噬初期 |
自噬小体 | 双层或多层膜的液泡状结构,内含胞浆成分,如线粒体、内质网、核糖体等 | 自噬中期 |
自噬溶酶体 | 单层膜,胞浆成分已降解 | 自噬后期 |
2)荧光显微镜法:LC3(light chain 3)全称MAP1LC3(microtubule-associated proteins light chain 3),贯穿整个自噬过程,是目前公认的自噬标记物。哺乳动物中的LC3与酵母中的自噬相关蛋白Apg8/Aut7/Atg8具有同源性。哺乳动物的LC3可分为三种:LC3A、LC3B和LC3C。其中,LC3B应用最为广泛。LC3蛋白合成后在其羧基端被Atg4剪切掉C端5肽,暴露甘氨酸残基,产生细胞浆定位的LC3-I。在自噬过程中,LC3-I会被包括Atg7和Atg3在内的泛素样体系修饰和加工,与磷脂酰乙醇胺(PE)相偶联,形成LC3-II并定位于自噬体内外膜上。自噬体和溶酶体融合后,外膜上的LC3-II被Atg4切割,产生LC3-I循环利用;内膜上的LC3-II被溶酶体酶降解,导致自噬溶酶体中LC3含量很低。因此,可以通过荧光显微镜观察内源性LC3或GFP-LC3,即可实现对自噬发生的检测。