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核酸提取
核酸分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA),其中RNA又可以根据功能的不同分为信使RNA(mRNA),核糖体RNA(rRNA)和转运RNA(tRNA)。核酸中因为嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键,所以核酸具有紫外吸收的特性,DNA钠盐的紫外吸收在260 nm附近,其吸光率以A260表示,在230 nm处于吸收低谷,因此可以使用紫外分光光度计对核酸进行定量及定性测定。核酸提取类型主要包括:
1)总RNA提取
总RNA中,75-85%为rRNA(主要是28S-26S/23S和18S/16S rRNA),其余的由mRNA、小分子RNA(包括tRNA、5S rRNA、miRNA、snRNA等)以及核仁小分子RNA(small nuceolar RNA,snoRNA)等组成。主要采用TRIzol法。采用TRIzol裂解细胞,解聚染色体,释放核酸;氯仿除蛋白,离心后回收水性酚相/水相(RNA提取必须是酸性酚或低盐水相);异丙醇沉淀,乙醇洗涤,挥干,溶解于DEPC水。
2)基因组DNA提取
进行基因结构和功能研究以及基因诊断,通常要求得到的片段长度不小于100~200 kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素,以保证DNA的完整性,为后续的实验打下基础。主要采用CTAB法、SDS法。以去污剂CTAB/SDS等处理样品,破坏细胞膜结构,裂解细胞(裂解液通常还有EDTA抑制DNase活性,Tris-Cl缓冲防止核酸被破坏,同时具有较高的NaCl浓度,维持核酸溶解性);加入氯仿去除蛋白复合物(有机相),离心分离,回收水相(内含核酸);异丙醇沉淀DNA,离心回收絮状DNA,梯度乙醇清洗,自然挥干,溶解DNA与TE buffer。
3)质粒抽提
质粒抽提方法即去除RNA,将质粒与细菌基因组 DNA分开,去除蛋白质及其它杂质,以得到相对纯净的质粒。主要采用试剂盒、碱裂解法。